福尔马林固定石蜡包埋（FFPE, Formalin-Fixed Paraffin-Embedded）组织是临床和基础研究中最常用的样本保存方式。数十年来，FFPE样本因其长期保存稳定性和丰富的临床信息价值，成为组织学、病理学以及生物标志物研究的重要资源。然而，FFPE组织中的蛋白提取用于质谱分析，一直是蛋白组学研究中的技术难点。

一、为什么FFPE组织蛋白提取困难？

FFPE组织样本经过福尔马林固定和石蜡包埋，主要存在以下挑战：

• 蛋白交联：福尔马林通过形成亚胺键和甲基化交联蛋白质，导致蛋白质空间结构紧密，难以溶解。
• 蛋白降解与修饰：长期存储可能造成蛋白降解、氧化或脱酰化，使得质谱检测敏感性降低。
• 石蜡干扰：石蜡包埋需在蛋白提取前彻底去除，否则会影响酶解效率及液相色谱-质谱（LC-MS）分离性能。

这些因素使得FFPE蛋白组学相比冷冻组织样本，提取效率和检测深度普遍受限。

二、FFPE蛋白提取的基本流程

在质谱分析前，FFPE蛋白提取通常包括四个关键步骤：脱蜡、复水、交联逆转（Antigen Retrieval）、蛋白溶解与酶解。

1、脱蜡与复水

石蜡阻碍蛋白酶（如胰蛋白酶）作用，因此必须先去除。常用方法包括：

• 有机溶剂脱蜡：二甲苯（Xylene）或柠檬烯类溶剂反复洗涤样本，去除石蜡。
• 梯度乙醇复水：脱蜡后用100%、95%、70%乙醇梯度下处理，最终复水至PBS或去离子水，为后续蛋白提取创造条件。

2、交联逆转（Antigen Retrieval）

交联逆转是FFPE蛋白质提取的核心环节，它决定了质谱检测的覆盖度和可靠性。常用方法有：

• 高温热解法：将样本置于含缓冲液（如Tris-HCl、SDS、Urea）的溶液中，高温（90-120°C）处理一定时间，使甲醛交联断裂。
• pH调控：酸性或碱性条件可促进蛋白交联断裂，同时提高蛋白溶解度。
• 压力辅助：微波、压力锅或高压蒸汽可加速交联逆转，提高蛋白提取效率。

高效的交联逆转方法能够显著提高低丰度蛋白在质谱中的可检测性。

3、蛋白溶解与酶解

在交联逆转后，蛋白需彻底溶解以便质谱分析：

• 溶解剂选择：常用SDS、Urea、Guanidine-HCl等强变性剂，帮助破坏蛋白二级和三级结构。
• 蛋白浓度测定：通过BCA法或Bradford法，确保酶解效率和后续定量分析的准确性。
• 酶解处理：胰蛋白酶是质谱前最常用的酶，通过将蛋白切割成可被MS检测的肽段，保证数据覆盖率。部分研究也使用Lys-C或Trypsin/Lys-C组合提高消化效率。

4、肽段净化与质谱分析

酶解后的肽段通常含有盐离子、去污剂残留，需要进行净化：

• 固相萃取（SPE）：C18柱常用于去除干扰物，保证液相色谱（LC）分离顺利。
• 质谱检测：LC-MS/MS或Orbitrap、Q-TOF等高分辨率质谱可对FFPE蛋白组进行高覆盖定量分析。

三、FFPE蛋白组学的优化策略

为了最大化FFPE样本的质谱可分析性，科研人员通常采用以下策略：

• 选择合适的缓冲体系：含SDS或Urea的缓冲液可兼顾交联逆转与蛋白溶解。
• 温度与时间优化：交联逆转时间过长可能造成蛋白降解，过短则提取效率低。建议根据样本类型进行预实验优化。
• 酶解条件调整：可通过提高酶-蛋白比或延长消化时间，确保低丰度蛋白的检测。
• 使用去交联增强剂：如DTT、TCEP等还原剂可以提高交联蛋白的可溶性，增强质谱信号。

四、FFPE蛋白组学在科研与临床中的应用

成功提取FFPE蛋白并进行质谱分析，可实现多种科研与临床目标：

• 生物标志物发现：挖掘癌症、心血管疾病和神经退行性疾病的蛋白表达差异。
• 信号通路解析：通过磷酸化或乙酰化修饰分析，揭示疾病相关信号通路。
• 长期队列研究：利用医院长期存储的FFPE样本，实现历史临床样本的蛋白组学研究。

近年来，质谱技术的灵敏度和覆盖度不断提升，使FFPE蛋白组学从方法学探索逐渐走向常规应用，为精准医疗和转化研究提供了有力工具。

FFPE组织蛋白提取虽然面临交联、降解和石蜡干扰等挑战，但通过合理的脱蜡、复水、交联逆转及酶解策略，结合高分辨质谱技术，可以实现高质量的蛋白组分析。对于科研人员来说，掌握这些方法不仅可以充分利用宝贵的临床样本，也为生物标志物发现和疾病机制研究提供坚实基础。在这一领域，百泰派克生物科技整合了先进的FFPE蛋白提取方案和高分辨质谱平台，提供定制化蛋白组学服务，帮助科研团队实现从样本处理到高质量数据分析的全流程解决方案。选择百泰派克生物科技，即可让您的FFPE蛋白组学研究更高效、更可靠。

百泰派克生物科技特色项目

一、蛋白测序

百泰派克生物科技使用Thermo公司新推出的Obitrap Fusion Lumos质谱仪及岛津公司埃德曼降解测序系统对蛋白质序列进行分析，提供基于质谱的蛋白测序分析服务，包括对蛋白质的氨基酸组成分析，N端测序，C端测序和全序列分析，以及基于埃德曼降解的蛋白质N端序列分析服务。对于未知理论序列的蛋白质，提供基于从头测序法的蛋白质从头测序服务，对蛋白序列进行分析。

※服务优势：

1.采用目前世界上先进的质谱仪器 Obitrap Fusion Lumos;

2.可实现对所测定靶蛋白序列 100% 的覆盖;

3.可测定蛋白N端多达 70个氨基酸序列;

4.可测定多种形式的样品: 蛋白溶液、PVDF 蛋白条带;

5.样品用量低: 蛋白样品仅需 5-10ug，即可完成检测;

6.测序不受N端封闭，PEC和和糖基化等N端修饰的影响。

二、蛋白质组学

百泰派克生物科技采用Thermo Fisher的Orbitrap Fusion Lumos质谱平台结合Nano-LC，提供定量蛋白质组学、靶向蛋白质组学、多肽组学、翻译后修饰蛋白组学等多种蛋白质组学分析服务。此外，百泰派克生物科技新推出基于timsTOF Pro的4D蛋白质组学服务，助力微量样本蛋白组学、大样本群医学及高通量修饰组学等研究工作。

※服务优势：

1 .高通量定量蛋白分析:多对照组大规模实验分析，发现新的生物标记物;

2.体内体外多种蛋白质标记方法，适用于分析组织、细胞、血液等多种样品;

3.质谱分析灵敏度高，实验结果重复度高;

4.可检测较低丰度蛋白，线性范围广;

5.专业生物信息学分析，分析更系统准确。

三、单细胞质谱流式技术分析

百泰派克生物科技采用Fluidigm质谱流式系统进行单细胞质谱流式技术分析，采用金属元素标记物（通常是金属元素标记的特异抗体）标记细胞表面和内部的分子，然后用流式细胞原理分离单个细胞，再用电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）分析单个细胞的原子质量谱，最后将原子质量谱数据转换为细胞表面和内部的信号分子表达量。

※服务优势：

1.技术先进，填补技术空白

采用金属标记抗体技术，避免了传统流式荧光通道少且易相互影响的问题。可在单细胞层面上对多种指标同时进行表征，百泰派克生物科技可做到同时检测51个目标蛋白。

2.分析数量大，成本较低

单细胞RNAseq受成本等因素限制，所有样本细胞汇总的分析数目一般在2x10^4个左右，而流式质谱技术一次（单样本）就可分析至少10^5的细胞，实现了数量级的提高，且成本不高于单细胞RNAseq。

3.应用前景大

①流式质谱结果可以给出细胞亚群的变化，在临床诊断、疾病机制研究等方面具有极大的研究前景；

②将金属标签技术与其他技术结合会有新应用方向。除常规蛋白外，质谱流式细胞技术还可用于蛋白翻译后修饰；

③可检测细胞存活率、细胞大小、mRNA转录子表达量、DNA合成速率以及蛋白酶活性等。

四、基于高精度质谱的免疫多肽组学分析及新抗原发现

百泰派克生物科技的基于高精度质谱的免疫多肽组学分析及新抗原发现一站式解决方案包括我们专有的、高度敏感的免疫肽富集和鉴定方案。我们能够帮助您实现10,000个以上I型多肽和10,000个以上II型多肽的鉴定和识别。通过我们优化的高通量免疫多肽组学分析平台进行免疫肽组学分析，可从最小的样品材料中进行可重复的识别和定量。该服务可以应用于大规模的研究，旨在助力科研工作者寻找癌症、免疫疾病及传染病的解决方案，深入挖掘未知的靶标。

五、生物药物表征

百泰派克基于高分辨率质谱技术，MALDI TOF，高效色谱分离技术，提供一系列完善的生物药物分析方案，从蛋白质、多肽、抗体、疫苗等生物制品的氨基酸组成和一级结构分析，到产品变异性和纯度分析。旨在提供优质生物药物分析服务，帮助生物医药生产商提高生物药物品质。

百泰派克生物科技七大检测平台

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北京百泰派克生物科技有限公司致力于为生物/制药和医疗器械行业提供质量控制检测和项目验证等专业服务。公司实验室遵循NMPA、ICH、FDA和EMA等的法规和指导原则，通过CNAS/ISO9001双重质量体系认证，建立了完备的质量体系，数据冷热/异地备份，设备定期计量/期间核查，软件审计追踪，为客户提供一体化解决方案和技术服务，支持新药研发、药物申报注册和生产放行。

1.公司采用ISO9001质量控制体系，专业提供以质谱为基础的CRO检测分析服务；

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