在临床研究和转化医学领域，福尔马林固定石蜡包埋（FFPE, Formalin-Fixed Paraffin-Embedded）组织样本因其长期稳定保存和丰富的临床信息，成为极具价值的生物资源。然而，FFPE样本在用于LC-MS蛋白质组学分析前，必须解决一个关键技术难题，即实现高效且具有良好重复性的去蜡处理（deparaffinization）。

一、为什么FFPE样本必须去蜡？

FFPE样本制备过程中，组织会经过福尔马林固定和石蜡包埋。石蜡的存在虽然有助于结构保存，但对蛋白质组学分析却带来多重干扰：

• 阻碍蛋白提取：石蜡形成疏水屏障，影响裂解液渗透
• 抑制酶解反应：残留石蜡会影响胰蛋白酶活性
• 污染质谱系统：石蜡成分可能导致LC-MS系统污染和信号抑制

因此，彻底去除石蜡是FFPE蛋白质组学样本前处理的第一步，也是决定数据质量的关键因素之一。

二、FFPE去蜡的基本原理

去蜡的核心原理基于“溶剂相似相溶”：

• 石蜡属于非极性物质
• 需使用非极性有机溶剂（如二甲苯）进行溶解
• 随后通过梯度乙醇逐步去除溶剂并复水

这一过程不仅是物理去除石蜡，同时也是为后续蛋白提取创造合适的水相环境。

三、经典去蜡方法：二甲苯法

1、标准流程

目前最常用的方法是二甲苯（xylene）去蜡法，其典型步骤如下：

（1）二甲苯脱蜡

• 加入1 mL二甲苯
• 室温振荡10分钟
• 离心（14,000 g, 5 min）
• 去除上清
• 重复2次

（2）梯度乙醇洗涤

• 100%乙醇（2次）
• 95%乙醇
• 70%乙醇
• 每步离心并弃上清

（3）水化处理

• 加入去离子水或缓冲液
• 准备进入蛋白裂解步骤

2、方法优势

• 去蜡效率高
• 适用于绝大多数FFPE样本
• 技术成熟、重复性好

3、方法局限

• 二甲苯具有毒性
• 多步操作可能导致样本损失
• 对低丰度蛋白有一定影响

四、替代去蜡方法：无二甲苯策略

随着蛋白质组学技术的发展，研究人员逐渐探索更温和、高效的去蜡方案。

1、热裂解去蜡法（Heat-induced deparaffinization）

利用高温（通常95°C以上）配合裂解缓冲液实现石蜡溶解：

（1）优点

• 简化流程（一步完成去蜡+裂解）
• 减少样本损失

（2）缺点

• 对部分蛋白可能造成降解
• 对缓冲体系要求较高

2、有机溶剂替代（如Heptane）

部分实验使用正庚烷（heptane）或其他低毒溶剂替代二甲苯：

• 毒性更低
• 对蛋白结构影响较小

但目前应用尚不如二甲苯广泛。

3、表面活性剂辅助法

使用SDS、SDC等表面活性剂：

• 直接乳化石蜡
• 与SP3、FASP等蛋白质组流程兼容

五、去蜡后关键步骤：蛋白提取与交联逆转

去蜡只是第一步，FFPE样本还面临另一个核心问题，即甲醛交联（formalin crosslinking）。

1、交联逆转策略

通常采用：

• 高温（95°C以上）
• 强变性剂（如SDS、urea）
• 长时间孵育（1-2小时）

2、蛋白提取优化

关键因素包括：

• 裂解缓冲液组成
• 超声或高压辅助裂解
• 蛋白回收方法（SP3、S-Trap等）

六、影响去蜡效果的关键因素

在实际实验中，去蜡效果直接影响蛋白质组数据质量，需重点关注以下因素：

1、样本厚度

• 切片过厚会影响溶剂渗透
• 推荐5-10 μm

2、去蜡时间

• 时间不足会残留石蜡
• 时间过长可能导致蛋白损失

3、离心效率

• 不充分离心会影响分层
• 建议≥14,000g

4、溶剂纯度

• 低纯度溶剂可能引入污染

七、LC-MS蛋白质组学中的最佳实践建议

为了获得高质量FFPE蛋白质组数据，建议遵循以下优化策略：

1、标准化流程

确保每批样本使用一致的去蜡和处理条件。

2、结合自动化平台

减少人为误差，提高重复性。

3、使用高灵敏度质谱系统

提升低丰度蛋白检测能力。

4、数据质量控制

包括：

• 肽段覆盖度
• 蛋白鉴定数量
• 重复性评估

八、FFPE蛋白质组学的应用前景

随着去蜡及前处理技术的不断优化，FFPE样本正在成为蛋白质组学的重要来源：

• 肿瘤标志物发现
• 回顾性临床研究
• 精准医学研究
• 空间蛋白质组学

其与LC-MS的结合，为临床样本深度挖掘提供了前所未有的机会。

FFPE组织的去蜡处理看似基础，却是决定LC-MS蛋白质组学成败的关键环节。从传统二甲苯法到新兴的无溶剂策略，技术的不断演进正在显著提升数据深度和可靠性。对于希望开展高质量FFPE蛋白质组研究的科研人员而言，选择合适的去蜡方法并优化整体流程至关重要。百泰派克生物科技依托先进Orbitrap质谱平台与优化的FFPE前处理流程，实现高深度蛋白鉴定、优异数据重复性及卓越临床样本适配能力，为肿瘤研究与转化医学提供一站式蛋白质组学解决方案。

百泰派克生物科技特色项目

一、蛋白测序

百泰派克生物科技使用Thermo公司新推出的Obitrap Fusion Lumos质谱仪及岛津公司埃德曼降解测序系统对蛋白质序列进行分析，提供基于质谱的蛋白测序分析服务，包括对蛋白质的氨基酸组成分析，N端测序，C端测序和全序列分析，以及基于埃德曼降解的蛋白质N端序列分析服务。对于未知理论序列的蛋白质，提供基于从头测序法的蛋白质从头测序服务，对蛋白序列进行分析。

※服务优势：

1.采用目前世界上先进的质谱仪器 Obitrap Fusion Lumos;

2.可实现对所测定靶蛋白序列 100% 的覆盖;

3.可测定蛋白N端多达 70个氨基酸序列;

4.可测定多种形式的样品: 蛋白溶液、PVDF 蛋白条带;

5.样品用量低: 蛋白样品仅需 5-10ug，即可完成检测;

6.测序不受N端封闭，PEC和和糖基化等N端修饰的影响。

二、蛋白质组学

百泰派克生物科技采用Thermo Fisher的Orbitrap Fusion Lumos质谱平台结合Nano-LC，提供定量蛋白质组学、靶向蛋白质组学、多肽组学、翻译后修饰蛋白组学等多种蛋白质组学分析服务。此外，百泰派克生物科技新推出基于timsTOF Pro的4D蛋白质组学服务，助力微量样本蛋白组学、大样本群医学及高通量修饰组学等研究工作。

※服务优势：

1 .高通量定量蛋白分析:多对照组大规模实验分析，发现新的生物标记物;

2.体内体外多种蛋白质标记方法，适用于分析组织、细胞、血液等多种样品;

3.质谱分析灵敏度高，实验结果重复度高;

4.可检测较低丰度蛋白，线性范围广;

5.专业生物信息学分析，分析更系统准确。

三、单细胞质谱流式技术分析

百泰派克生物科技采用Fluidigm质谱流式系统进行单细胞质谱流式技术分析，采用金属元素标记物（通常是金属元素标记的特异抗体）标记细胞表面和内部的分子，然后用流式细胞原理分离单个细胞，再用电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）分析单个细胞的原子质量谱，最后将原子质量谱数据转换为细胞表面和内部的信号分子表达量。

※服务优势：

1.技术先进，填补技术空白

采用金属标记抗体技术，避免了传统流式荧光通道少且易相互影响的问题。可在单细胞层面上对多种指标同时进行表征，百泰派克生物科技可做到同时检测51个目标蛋白。

2.分析数量大，成本较低

单细胞RNAseq受成本等因素限制，所有样本细胞汇总的分析数目一般在2x10^4个左右，而流式质谱技术一次（单样本）就可分析至少10^5的细胞，实现了数量级的提高，且成本不高于单细胞RNAseq。

3.应用前景大

①流式质谱结果可以给出细胞亚群的变化，在临床诊断、疾病机制研究等方面具有极大的研究前景；

②将金属标签技术与其他技术结合会有新应用方向。除常规蛋白外，质谱流式细胞技术还可用于蛋白翻译后修饰；

③可检测细胞存活率、细胞大小、mRNA转录子表达量、DNA合成速率以及蛋白酶活性等。

四、基于高精度质谱的免疫多肽组学分析及新抗原发现

百泰派克生物科技的基于高精度质谱的免疫多肽组学分析及新抗原发现一站式解决方案包括我们专有的、高度敏感的免疫肽富集和鉴定方案。我们能够帮助您实现10,000个以上I型多肽和10,000个以上II型多肽的鉴定和识别。通过我们优化的高通量免疫多肽组学分析平台进行免疫肽组学分析，可从最小的样品材料中进行可重复的识别和定量。该服务可以应用于大规模的研究，旨在助力科研工作者寻找癌症、免疫疾病及传染病的解决方案，深入挖掘未知的靶标。

五、生物药物表征

百泰派克基于高分辨率质谱技术，MALDI TOF，高效色谱分离技术，提供一系列完善的生物药物分析方案，从蛋白质、多肽、抗体、疫苗等生物制品的氨基酸组成和一级结构分析，到产品变异性和纯度分析。旨在提供优质生物药物分析服务，帮助生物医药生产商提高生物药物品质。

百泰派克生物科技七大检测平台

百泰派克生物科技-生物制品表征，生物质谱多组学优质服务商

北京百泰派克生物科技有限公司致力于为生物/制药和医疗器械行业提供质量控制检测和项目验证等专业服务。公司实验室遵循NMPA、ICH、FDA和EMA等的法规和指导原则，通过CNAS/ISO9001双重质量体系认证，建立了完备的质量体系，数据冷热/异地备份，设备定期计量/期间核查，软件审计追踪，为客户提供一体化解决方案和技术服务，支持新药研发、药物申报注册和生产放行。

1.公司采用ISO9001质量控制体系，专业提供以质谱为基础的CRO检测分析服务；

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