外泌体是直径30–150纳米的细胞分泌囊泡，广泛存在于血液、尿液及其他体液中。它们富含蛋白质、RNA和脂质，作为细胞间信号传递的重要媒介，在疾病诊断、药物靶点发现及治疗研究中具有巨大价值。随着质谱技术的发展，高通量、精准的蛋白定量分析方法成为外泌体研究的核心工具。其中，TMT（Tandem Mass Tag）标记定量和DIA（Data-Independent Acquisition）数据独立采集技术因其高灵敏度、可重复性和覆盖率而受到广泛关注。

一、外泌体定量蛋白质组分析的核心意义

外泌体定量蛋白质组分析不仅能揭示细胞状态，还能发现疾病相关生物标志物、药物靶点以及细胞间通信网络。相比蛋白质组学，外泌体样本量小、蛋白种类低丰度蛋白多，因此高灵敏、高覆盖率的定量方法显得尤为重要。

TMT 和 DIA 技术在这一领域的优势如下：

• TMT：支持多样本同时定量，便于比较不同处理条件或疾病状态。
• DIA：实现高重现性和深度覆盖，尤其适合复杂生物样本的系统分析。

二、外泌体样本制备与蛋白提取

在进行 TMT/DIA 定量之前，外泌体样本的高质量制备是关键。主要流程包括：

1、外泌体分离

常用方法：

• 超速离心：多级离心去除细胞碎片和大颗粒，获得沉淀外泌体。
• 密度梯度离心：利用蔗糖或碘梯度提高纯度，适合蛋白组学分析。
• 免疫亲和法：通过CD63/CD9/CD81抗体选择性捕获，适合低丰度蛋白检测。

2、蛋白提取

外泌体蛋白量有限，需要使用高效裂解缓冲液（含去污剂和蛋白酶抑制剂）：

• 确保膜蛋白充分溶解。
• 保持蛋白修饰状态完整。

3、蛋白定量

常用 BCA 法或Bradford 法进行精确定量，为后续 TMT 或 DIA 分析提供准确蛋白输入量。

三、TMT 标记定量策略

1、原理简介

TMT 是一种同位素标记技术，通过化学修饰在肽段 N 端或赖氨酸残基引入标记，实现多样本的相对定量。每个标记具有相同质荷比（m/z），在质谱碎片化后释放不同的报告离子（Reporter Ion）信号，用于定量比较。

2、TMT 流程

• 蛋白酶解：常用胰蛋白酶将蛋白切割成肽段。
• 肽段标记：将各实验组肽段分别与不同 TMT 标签反应。
• 样本混合：将标记肽段混合，统一进行 LC-MS/MS 分析。
• 质谱分析：使用高分辨率 Orbitrap 或 Q-Exactive 系统进行 DDA 数据采集。
• 数据解析：通过数据库搜索和 Reporter Ion 定量分析，获得多样本相对定量结果。
• 可同时分析 6–18 个样本，节省质谱运行时间。
• 避免批次效应，提高实验可重复性。
• 适合临床样本对照、药物处理或疾病分型研究。

1、原理简介

DIA 是一种非选择性采集方式，将质谱扫描窗口覆盖样本中所有肽段，实现“全谱采集”。通过建立肽库或直接分析谱图，DIA 能够高效、准确地进行蛋白定量。

2、DIA 流程

• 蛋白酶解与肽段制备：与 TMT 类似，但无需标记。
• 液相色谱分离：将复杂肽段样本分离后送入质谱。
• DIA 采集：在预设质量窗口内连续采集所有肽段信号。
• 数据分析：利用Spectronaut或DIA-NN等软件解析数据，实现蛋白定量与鉴定。
• 高重复性，适合多批次分析。
• 无需标记，适合低丰度样本。
• 深度覆盖，可检测低丰度和膜蛋白。
• 支持时间序列、处理组和复杂疾病模型研究。

五、数据分析与生物学解读

外泌体定量蛋白质组数据需要经过系统分析：

1、蛋白鉴定与定量：通过 UniProt 数据库及 MaxQuant、Spectronaut 软件完成。

2、统计分析：包括差异蛋白筛选、聚类分析、PCA 可视化。

3、功能注释：GO 富集、KEGG 通路分析、蛋白互作网络构建。

4、临床/机制关联：与疾病表型或药物处理结果进行关联分析，发现潜在标志物或作用机制。

利用 TMT 和 DIA 技术进行外泌体定量蛋白质组分析，为疾病生物标志物发现、药物作用机制研究及再生医学提供了强有力的工具。百泰派克生物科技结合 TMT 与 DIA 平台，提供优化的外泌体定量蛋白质组全流程服务，从样本制备到数据分析，实现高灵敏度、可重复的科研解决方案。随着技术的发展，外泌体定量蛋白组学将在精准医学、肿瘤早期诊断和个性化治疗中发挥越来越重要的作用。

百泰派克生物科技特色项目

一、蛋白测序

百泰派克生物科技使用Thermo公司新推出的Obitrap Fusion Lumos质谱仪及岛津公司埃德曼降解测序系统对蛋白质序列进行分析，提供基于质谱的蛋白测序分析服务，包括对蛋白质的氨基酸组成分析，N端测序，C端测序和全序列分析，以及基于埃德曼降解的蛋白质N端序列分析服务。对于未知理论序列的蛋白质，提供基于从头测序法的蛋白质从头测序服务，对蛋白序列进行分析。

※服务优势：

1.采用目前世界上先进的质谱仪器 Obitrap Fusion Lumos;

2.可实现对所测定靶蛋白序列 100% 的覆盖;

3.可测定蛋白N端多达 70个氨基酸序列;

4.可测定多种形式的样品: 蛋白溶液、PVDF 蛋白条带;

5.样品用量低: 蛋白样品仅需 5-10ug，即可完成检测;

6.测序不受N端封闭，PEC和和糖基化等N端修饰的影响。

二、蛋白质组学

百泰派克生物科技采用Thermo Fisher的Orbitrap Fusion Lumos质谱平台结合Nano-LC，提供定量蛋白质组学、靶向蛋白质组学、多肽组学、翻译后修饰蛋白组学等多种蛋白质组学分析服务。此外，百泰派克生物科技新推出基于timsTOF Pro的4D蛋白质组学服务，助力微量样本蛋白组学、大样本群医学及高通量修饰组学等研究工作。

※服务优势：

1 .高通量定量蛋白分析:多对照组大规模实验分析，发现新的生物标记物;

2.体内体外多种蛋白质标记方法，适用于分析组织、细胞、血液等多种样品;

3.质谱分析灵敏度高，实验结果重复度高;

4.可检测较低丰度蛋白，线性范围广;

5.专业生物信息学分析，分析更系统准确。

三、单细胞质谱流式技术分析

百泰派克生物科技采用Fluidigm质谱流式系统进行单细胞质谱流式技术分析，采用金属元素标记物（通常是金属元素标记的特异抗体）标记细胞表面和内部的分子，然后用流式细胞原理分离单个细胞，再用电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）分析单个细胞的原子质量谱，最后将原子质量谱数据转换为细胞表面和内部的信号分子表达量。

※服务优势：

1.技术先进，填补技术空白

采用金属标记抗体技术，避免了传统流式荧光通道少且易相互影响的问题。可在单细胞层面上对多种指标同时进行表征，百泰派克生物科技可做到同时检测51个目标蛋白。

2.分析数量大，成本较低

单细胞RNAseq受成本等因素限制，所有样本细胞汇总的分析数目一般在2x10^4个左右，而流式质谱技术一次（单样本）就可分析至少10^5的细胞，实现了数量级的提高，且成本不高于单细胞RNAseq。

3.应用前景大

①流式质谱结果可以给出细胞亚群的变化，在临床诊断、疾病机制研究等方面具有极大的研究前景；

②将金属标签技术与其他技术结合会有新应用方向。除常规蛋白外，质谱流式细胞技术还可用于蛋白翻译后修饰；

③可检测细胞存活率、细胞大小、mRNA转录子表达量、DNA合成速率以及蛋白酶活性等。

四、基于高精度质谱的免疫多肽组学分析及新抗原发现

百泰派克生物科技的基于高精度质谱的免疫多肽组学分析及新抗原发现一站式解决方案包括我们专有的、高度敏感的免疫肽富集和鉴定方案。我们能够帮助您实现10,000个以上I型多肽和10,000个以上II型多肽的鉴定和识别。通过我们优化的高通量免疫多肽组学分析平台进行免疫肽组学分析，可从最小的样品材料中进行可重复的识别和定量。该服务可以应用于大规模的研究，旨在助力科研工作者寻找癌症、免疫疾病及传染病的解决方案，深入挖掘未知的靶标。

五、生物药物表征

百泰派克基于高分辨率质谱技术，MALDI TOF，高效色谱分离技术，提供一系列完善的生物药物分析方案，从蛋白质、多肽、抗体、疫苗等生物制品的氨基酸组成和一级结构分析，到产品变异性和纯度分析。旨在提供优质生物药物分析服务，帮助生物医药生产商提高生物药物品质。

百泰派克生物科技七大检测平台

百泰派克生物科技-生物制品表征，生物质谱多组学优质服务商

北京百泰派克生物科技有限公司致力于为生物/制药和医疗器械行业提供质量控制检测和项目验证等专业服务。公司实验室遵循NMPA、ICH、FDA和EMA等的法规和指导原则，通过CNAS/ISO9001双重质量体系认证，建立了完备的质量体系，数据冷热/异地备份，设备定期计量/期间核查，软件审计追踪，为客户提供一体化解决方案和技术服务，支持新药研发、药物申报注册和生产放行。

1.公司采用ISO9001质量控制体系，专业提供以质谱为基础的CRO检测分析服务；

2.获国家CNAS实验室认可，为客户提供符合全球药政法规的药物质量研究服务；

3.业务范围覆盖蛋白质组学、多肽组学、代谢组学、生物药物表征、单细胞分析、单细胞质谱流式、生信云分析以及多组学生物质谱整合分析等；

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