基于活性的蛋白质组学分析技术（Activity-Based Protein Profiling，ABPP）是在活性化合物探针与蛋白质组学技术基础上发展而来的小分子钓靶技术。随着科学技术的迅速发展，高通量质谱和点击化学（Click Chemistry）的融合极大提高了分析的灵敏度、分辨率以及化合物探针的生物相容性。基于炔基或光交联基团标记的ABPP技术目前被广泛应用于化合物结合靶蛋白的筛选与鉴定，为阐明活性化合物的作用机制提供了关键助力。

图1  ABPP技术实验流程图

半胱氨酸作为蛋白质组中功能极为重要的氨基酸，具有高反应性和多功能特性，能够参与如酶的催化和变构调控等多种生物学过程。由于其高反应性，半胱氨酸已成为共价药物设计的理想结合位点。由此，鉴定小分子化合物在细胞内结合靶蛋白的半胱氨酸位点，在药物靶点发现、先导化合物优化和基础生物学机制研究中具有重要作用。近年来，针对蛋白质半胱氨酸鉴定的ABPP技术层出不穷。

2010年，来自斯克利普斯研究所的Benjamin F. Cravatt研究团队于《Nature》发表了一项题为“Quantitative reactivity profiling predicts functional cysteines in proteomes”的研究。该研究在ABPP技术的基础上开发了一种竞争性活性导向蛋白质分析方法——基于同位素标记串联正交酶水解的活性蛋白质分析技术（isotopic Tandem Orthogonal Protease-activity-based Protein Profiling，isoTOP-ABPP）。首先被应用于在全蛋白质组范围内定量分析半胱氨酸的反应活性。

isoTOP-ABPP技术中设计了一种独特的探针结构：炔基化的碘乙酰胺（IA-Alkyne）。将其处理蛋白质组样本后，IA（碘乙酰胺）能够与活性半胱氨酸残基发生共价结合（本质是半胱氨酸巯基（-S⁻）对碘乙酰胺 α-C 的 Sₙ2 亲核取代反应）。随后，引入同位素标签“轻（Light）”“重（Heavy）”以区分实验组与对照组。再通过点击化学将带有叠氮基团的富集标签（Azide-TEV-Biotin）链接到活性探针的炔基基团（该标签包括：叠氮Azide：与炔基发生点击化学反应；生物素Biotin：用于链霉亲和素磁珠的富集；TEV蛋白酶酶切位点：用于后续的特异性酶解释放）。利用链霉亲和素磁珠处理样品，再利用TEV蛋白酶进行处理，释放出被标记半胱氨酸的肽段，更利于后续的质谱鉴定。最后，通过质谱分析，比较轻/重同位素信号的比率（Ratio），就能够精确判断出具有反应性的半胱氨酸位点。

图2  isoTOP-ABPP技术实验流程导图

在此基础上，该团队在2013年于《Nature Methods》发表了题为“A chemoproteomic platform to quantitatively map targets of lipid-derived electrophiles”的另一研究。在该研究中，团队利用“竞争性结合”这一概念，通过对比分析小分子化合物与探针作用后标记信号的改变，来鉴定小分子在细胞中与靶蛋白结合的具体半胱氨酸位点。

不同于之前技术中化合物对蛋白质的直接标记，竞争性isoTOP-ABPP先将待研究的小分子化合物处理实验组样品，用等量的对照溶剂处理对照组样品。随后在两组中分别加入IA-Alkyne探针进行竞争标记。最后，通过点击化学反应及质谱分析，比较实验组与对照组样品，其中标记信号显著降低的位点即是小分子化合物的潜在结合位点。

isoTOP-ABPP技术作为一种“发现”工具，能够全局性、无偏倚地绘制化合物在整个蛋白质组中所有反应性半胱氨酸的活性图谱。

竞争性isoTOP-ABPP作为一种“筛选”工具，能够精准鉴定小分子化合物在复杂蛋白质组中结合靶蛋白的具体半胱氨酸位点，对于理解药物作用机制和挖掘潜在副作用具有关键作用。此外，还能够定量比较同一化合物对于不同靶点结合位点的占据效率，以评估其选择性，为结构优化提供指导。

近年来，随着相关研究的推进，国际顶级期刊中采用该技术开展的研究越来越多，其应用场景也愈发广泛。在这里，小编按照时间顺序整理了3篇发表于CNS正刊中应用isoTOP-ABPP技术的研究文章，和大家一起学习。（更多相关文献见文末列表）

2023年5月15日，哈佛大学医学院的研究团队在《Cell》上发表了题为“Systematic identification of anticancer drug targets reveals a nucleus-to-mitochondria ROS-sensing pathway”的研究文章。

技术目的：该研究整合活性蛋白组学及基因筛选等技术，对11种抗癌药物诱导ROS产生的内在机制展开研究。利用isoTOP-ABPP技术全局性、无偏向地发现和定量细胞内成千上万个半胱氨酸残基在抗癌药物处理后的反应性变化。该技术能够尽可能的捕获半胱氨酸多种修饰类型（包括氧化、化合物直接修饰、ROS相关代谢物加合），还能反映初级和次级ROS活性效应。

技术应用与结果：在鉴定出的35656个半胱氨酸和8297个蛋白质中，发现2910个蛋白质中的4980个半胱氨酸存在反应性变化（与载体对照相比，iso-TMT比率（R）显示反应性变化≥1.5倍的半胱氨酸）。根据反应性变化模式将半胱氨酸分为4个簇进行特征分析（图3A-B），并通过新开发的“半胱氨酸反应性评分”发现多种抗癌药物诱导的半胱氨酸靶点（图3C-D），为理解药物机制和开发新疗法提供了关键数据支持。

图3  系统性鉴定抗癌药物靶点，揭示细胞核-线粒体ROS感应通路

2023年11月2日，美国加州大学伯克利分校的研究团队在《Science》上发表了题为“Formaldehyde regulates S-adenosylmethionine biosynthesis and one-carbon metabolism”的研究文章。

技术目的：该研究发现了甲醛（FA）与S - 腺苷甲硫氨酸（SAM）作为细胞中的一碳单位参与代谢与表观遗传调控的重要作用。利用isoTOP-ABPP技术分析发现甲醛能够特异性且选择性地修饰蛋白质组中特定的半胱氨酸残基。甲醛作为一种选择性亲电信号分子，通过剂量依赖性方式，特异性结合 SAM 合成终末酶（MAT1A）的Cys120位点，抑制SAM生成并降低细胞甲基化潜力。该研究揭示甲醛可通过位点特异性翻译后修饰调控细胞核心代谢，为理解一碳单位间的相互作用及相关疾病机制提供了新的视角。

技术应用与结果：研究者使用接近疾病水平浓度的甲醛处理小鼠脾脏裂解液，通过isoTOP-ABPP鉴定出576个对甲醛高度敏感的半胱氨酸位点（图4A-B），进一步分析得知，这些被甲醛修饰的蛋白质并非随机分布，而是显著富集于与甲醛代谢和一碳代谢相关的关键通路中（图4C-D）。证实甲醛应被视为一种选择性亲电信号分子，而非非特异性损伤剂，它通过修饰特定功能通路（尤其是一碳代谢）中的关键半胱氨酸残基来可能调控细胞功能。

图4  蛋白质组全范围鉴定破译甲醛作为信号传导剂，对于生物合成与一碳代谢的调控作用

2024年4月22日，麻省总医院癌症中心的研究团队在《Cell》上发表了题为“DrugMap: A quantitative pan-cancer analysis of cysteine ligandability”的研究文章。

技术目的：isoTOP-ABPP技术已推动针对多种癌症半胱氨酸靶点的共价抑制剂分子的研发。然而不同致癌背景如何影响半胱氨酸的靶向性仍不明确。由此，研究者开发了一份涵盖416种癌细胞系的半胱氨酸可配体结合性图谱——“DrugMap”，并在此基础上揭示了不同癌症间半胱氨酸可配体结合性的异质性，明确了驱动半胱氨酸靶向性的细胞内在特征，并为利用共价探针破坏致癌转录因子活性提供了实践范例。

技术应用与结果：研究者为绘制跨多种癌症的半胱氨酸可配体性综合图谱，选择了来自25种癌症亚型（谱系）的416种细胞系，每个谱系平均由约18个细胞系代表，较罕见的癌症也至少由两个细胞系覆盖（图5A）。随后利用isoTOP-ABPP与串联质谱标签（TMT）技术相结合，测量半胱氨酸的反应性。结果共定量了78523个半胱氨酸，发现其中5957个具有可配体性（图5B）。进一步，将数据与多组学信息进行整合，并通过新开发的计算工具——半胱氨酸集富集分析（CSEA）进行深入挖掘，最终形成了一个多维度、可交互探索的研究平台“DrugMap”，为揭示跨癌症的丰富而详细的半胱氨酸可配体研究提供了数据支撑，也为未来开发癌症靶向药物提供了可行可用的全新策略（图5C）。

图5  DrugMap：跨癌症研究中全面鉴定半胱氨酸可配体结合性